多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是臨床常見的內(nèi)分泌及代謝紊亂性疾病，病因尚不清楚，在育齡婦女中較為高發(fā)，以卵泡發(fā)育障礙、胰島素抵抗和高雄激素血癥為主要特征。PCOS是當代生殖醫(yī)學領(lǐng)域研究的熱點之一。當PCOS不孕患者經(jīng)過標準促排卵治療仍未妊娠，或合并其他助孕指征，可行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）助孕治療。在IVF控制性超促排卵（COH）過程中，常常在卵泡接近成熟時使用外源性人絨毛膜促性腺激素（hCG）以模擬內(nèi)源性黃體生成素（LH）峰作用，促進卵泡最后的成熟，稱為hCG扳機，因此，hCG扳機時間至關(guān)重要。臨床上在至少3個主導卵泡徑線≥17 mm或者2個主導卵泡徑線≥18 mm時考慮行hCG扳機。扳機日除了要關(guān)注卵泡直徑還應(yīng)重視成熟卵泡數(shù)量，既要獲得足夠數(shù)量的成熟卵子又不降低卵子質(zhì)量，目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一標準。有研究認為妊娠率隨著成熟卵泡比例的增加而升高，也有研究認為高成熟卵泡比例組卵子發(fā)育潛能反而降低。關(guān)于PCOS患者hCG注射日成熟卵泡比例對妊娠結(jié)局的影響研究甚少。2011年Genro等首次提出卵泡輸出率（FORT）的概念，即hCG注射日雙側(cè)卵巢排卵前16~22 mm 卵泡個數(shù)與促排卵前2~8 mm竇卵泡個數(shù)的百分比，用于評估不孕患者卵巢反應(yīng)性及妊娠結(jié)局。在COH周期中，同一批發(fā)育的徑線稍小的卵泡（例如直徑14~16 mm）也可獲得成熟卵母細胞，hCG注射后這部分卵泡將會進一步發(fā)育成熟，因此本研究采用直徑≥14 mm的卵泡數(shù)計算hCG注射日成熟卵泡數(shù)占比和FORT，并分析其對PCOS患者卵泡期長效長方案新鮮胚胎移植妊娠結(jié)局的影響，為控制性促排卵的治療提供臨床依據(jù)。
資料與方法
1.研究對象及分組：回顧性隊列研究分析2017年5月至2018年5月期間在鄭州大學第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心接受卵泡期長效長方案新鮮胚胎移植的PCOS患者的臨床資料。納入標準：①符合鹿特丹診斷標準，診斷為PCOS；②具有IVF/卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（ICSI）指征；③卵泡期長效長方案降調(diào)節(jié)；④hCG扳機后取卵并行新鮮胚胎移植患者。排除標準：①子宮及卵巢手術(shù)史；②子宮內(nèi)膜異位癥；③子宮腺肌??；④雙側(cè)輸卵管積水；⑤復發(fā)性自然流產(chǎn)等。根據(jù)hCG注射日直徑≥14 mm卵泡數(shù)占比［（hCG注射日直徑≥14 mm的卵泡數(shù)/hCG注射日卵泡總數(shù)）×100%］分為3組：A組，比例≤60%；B組，比例為60%~80%；C組，比例≥80%。根據(jù)FORT（hCG注射日直徑≥14 mm的卵泡數(shù)/促排卵前竇卵泡總數(shù)×100%）分為3組：D組，比例≤40%；E組，比例為40%~60%；F組，比例≥60%。根據(jù)移植結(jié)局，將患者分為妊娠組及未妊娠組。本研究符合《赫爾辛基宣言》基本原則。
2.COH方案：所有患者均于月經(jīng)周期第2~3日肌內(nèi)注射長效促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a，達菲林，法國益普生）3.75 mg降調(diào)節(jié)，約于降調(diào)節(jié)30 d查血清激素［卵泡刺激素（FSH）、雌二醇、孕酮、LH］及陰道超聲，若達降調(diào)節(jié)標準（FSH≤5 IU/L、LH≤5 IU/L、雌二醇<50 ng/L、孕酮<1 µg/L、內(nèi)膜厚度≤5 mm、雙側(cè)竇卵泡直徑≤5 mm），加用促性腺激素（Gn）進行COH，每日給予重組FSH（果納芬，瑞士默克雪蘭諾）促卵泡發(fā)育。根據(jù)患者的年齡、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)（AFC）、生殖激素水平、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）和卵巢功能決定其起始劑量，根據(jù)卵泡發(fā)育情況適時添加人絕經(jīng)期促性腺激素（hMG，珠海麗珠制藥），根據(jù)卵泡發(fā)育大小及血清LH、雌二醇水平調(diào)整Gn用量和使用時間。
3.取卵、IVF及胚胎移植：患者雙側(cè)卵巢至少2枚卵泡直徑達18~20 mm以上時，結(jié)合雌二醇水平確定“hCG扳機”時間，當晚皮下注射艾澤（瑞士默克雪蘭諾）250 μg，注射后36~38 h 經(jīng)陰道超聲引導下取卵。取卵當日給予黃體支持，黃體酮凝膠（瑞士默克雪蘭諾）1支/d陰道給藥。同時男方取精，行IVF或ICSI授精，取卵后3~5 d行新鮮胚胎移植。新鮮胚胎移植后14 d檢測血清β-hCG水平確定是否妊娠，若血清β-hCG≥5 IU/L，則判定為生化妊娠；移植后30~35 d行B超檢查，超聲下見孕囊為臨床妊娠。
4.臨床及實驗室各項指標的觀察：患者的一般情況，包括年齡、基礎(chǔ)FSH（bFSH）、BMI、不孕年限和AFC。COH監(jiān)測指標，包括Gn總量、Gn啟動量、Gn使用時間、hCG注射日雌二醇、LH和孕酮水平。實驗室指標，包括獲卵數(shù)、雙原核（2PN）受精率、可利用囊胚形成率（可利用囊胚為囊胚腔評分為3期及以上，內(nèi)細胞團或滋養(yǎng)層細胞其中之一的評分高于C級的囊胚）、移植胚胎數(shù)、移植日子宮內(nèi)膜厚度。胚胎移植結(jié)局監(jiān)測指標，包括胚胎種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率和卵巢過度刺激綜合征（OHSS）發(fā)生率等。2PN受精率=2PN數(shù)/獲卵數(shù)×100%；可利用囊胚形成率=可利用囊胚形成數(shù)/囊胚培養(yǎng)數(shù)×100%；胚胎種植率=超聲見孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；OHSS發(fā)生率=OHSS發(fā)生周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。
5.統(tǒng)計學方法：采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料符合正態(tài)分布時以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。臨床妊娠的影響因素分析采用二元logistic回歸分析法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
結(jié)果
1. hCG注射日直徑≥14 mm卵泡占比分組各項指標的比較：A組的Gn使用時間與Gn總用量大于B組和C組（P<0.001），但Gn啟動劑量低于B組和C組（P=0.026），B組和C組間差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。hCG注射日雌二醇水平、hCG注射日孕酮水平及獲卵數(shù)隨著hCG注射日直徑≥14 mm卵泡數(shù)占比的增加而增加（P<0.001）。A組2PN受精率小于B組（P=0.013），余組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。3組間可利用囊胚率、胚胎種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；C組的OHSS發(fā)生率顯著大于A組（P=0.008），余組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表1）。
2. 根據(jù)FORT分組各項指標的比較：D組的Gn使用時間與Gn總用量大于E組和F組（P<0.001），F(xiàn)組的Gn啟動劑量大于E組和F組（P=0.019）；隨著FORT的增加，hCG注射日雌二醇水平、hCG注射日孕酮水平及獲卵數(shù)隨之增加（P<0.001）；F組2PN受精率明顯低于D組（P=0.009）和E組（P<0.001），D組與E組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；F組胚胎種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率低于E組（P=0.002、P=0.007、P=0.011），D組與其他兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；F組的OHSS發(fā)生率顯著大于D組（P=0.010），余組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表2）。
3. 妊娠組與未妊娠組臨床及實驗室各項指標的比較：妊娠組2PN受精率和可利用囊胚率高于未妊娠組（P=0.041，P<0.001）；未妊娠組FORT高于妊娠組（P=0.031），而hCG注射
日直徑≥14 mm卵泡數(shù)占比組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；在年齡、BMI、AFC、獲卵數(shù)等方面，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表3）。
4. 影響臨床妊娠相關(guān)因素的二元logistic回歸分析：以臨床妊娠與否為因變量，校正混雜因素（年齡、AFC、獲卵數(shù)、2PN受精率、可利用囊胚率等）后結(jié)果顯示AFC、可利用囊胚率、FORT對臨床妊娠的影響有統(tǒng)計學意義，其余指標對臨床妊娠結(jié)局的影響無統(tǒng)計學意義（表4）。
討論
PCOS不孕患者首要的治療方法是誘發(fā)排卵，當通過調(diào)整生活方式與促排卵失敗時，或當患者合并有其他助孕指征時，可以考慮進行IVF治療。由于PCOS患者特殊的內(nèi)分泌紊亂，其對藥物的反應(yīng)性無法預測，在促排卵的過程中容易出現(xiàn)多卵泡發(fā)育、卵子質(zhì)量下降、OHSS等風險，或者對促排卵藥物不反應(yīng)或卵泡期過長，提早黃素化等，合適的COH方案及hCG扳機時機至關(guān)重要。本研究分別按hCG注射日直徑≥14 mm卵泡數(shù)占比和FORT分為高、中及低比例組，研究各組對卵泡期長效長方案新鮮胚胎移植妊娠結(jié)局的影響。
先前的研究以及臨床治療中，多采用年齡、AFC、bFSH、抗苗勒管激素（AMH）等指標來預測卵巢的反應(yīng)性及妊娠結(jié)局，Genro于2011年最早提出了FORT的概念，并將其用之于臨床。Rehman等和Gallot等認為，F(xiàn)ORT可以預測獲卵數(shù)、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局。Hassan等認為，F(xiàn)ORT是影響臨床妊娠率的獨立因素，隨著FORT值增大，獲卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)增加，種植率和妊娠率增高。Zhang等認為PCOS患者的中比例FORT和非PCOS患者的高比例FORT可以得到更好的妊娠結(jié)局，這與卵巢反應(yīng)異質(zhì)性有關(guān)。本研究顯示妊娠組FORT顯著低于未妊娠組，F(xiàn)ORT高比例組（F組）2PN受精率低于FORT中、低比例組（D和E組），F(xiàn)ORT高比例組（F組）臨床妊娠率及活產(chǎn)率低于FORT中比例組（D組），得知中、低比例的FORT可獲得較好的妊娠結(jié)局。卵巢功能正常的患者竇卵泡數(shù)相對有限，F(xiàn)SH受體飽和后，產(chǎn)生的雌激素量與之相對應(yīng)，雌激素分泌高峰維持24 h左右后逐漸下降。PCOS患者的AFC是正?；颊叩?~3倍，Gn刺激大量卵巢顆粒細胞分泌雌二醇，使其劑量明顯增加，雌激素的分泌在達到峰濃度之后會呈現(xiàn)顯著下降趨勢。有學者認為注射hCG前雌激素的下降與卵泡閉鎖或提前黃素化有關(guān)，最終導致低受精率和卵裂率，故妊娠率降低。hCG注射日高濃度雌二醇水平也可能通過影響卵子質(zhì)量、胚胎發(fā)育或子宮內(nèi)膜容受性影響輔助生殖的結(jié)局。以往文獻指出高雌激素患者雖可獲得較多卵子，但會產(chǎn)生不成熟或過熟卵子，這些卵子受精后分裂不佳，形成低質(zhì)量胚胎；一個COH周期有過多的卵子發(fā)育成熟，可能使質(zhì)量差的卵子比例增高，導致可利用胚胎率降低。另外高FORT組大卵泡比例增高，當卵泡超過一定徑線時容易出現(xiàn)黃素化和卵母細胞老化，從而導致卵母細胞質(zhì)量下降，優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)目減少，并最終影響患者的妊娠結(jié)局。過高的血清雌二醇水平可以改變與著床密切相關(guān)的分子、發(fā)育基因以及子宮內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)的時序性表達，使子宮內(nèi)膜組織學變化與正常生理改變不符，導致腺體發(fā)育和間質(zhì)發(fā)育的不同步，使種植窗的開放與胚泡的發(fā)育不同步，影響胚胎著床，最終影響妊娠結(jié)局。
有研究表明在GnRH-a長方案中，hCG注射日成熟卵泡比例（≥18 mm/≥10 mm）對PCOS患者臨床妊娠結(jié)局無影響，延遲hCG扳機時間可能會增加OHSS的風險，這與本研究結(jié)論一致。本研究結(jié)果顯示隨著hCG注射日卵泡直徑≥14 mm數(shù)占比升高，獲卵數(shù)增加，可移植胚胎數(shù)隨之增加，可能會提高累積妊娠率，但不影響臨床妊娠率和活產(chǎn)率。在COH過程中，使用促排卵藥物刺激多個卵泡共同發(fā)育，由于每個卵泡對FSH的敏感性不同，對FSH敏感的卵泡逐漸發(fā)育成優(yōu)勢卵泡，其他卵泡則可能發(fā)育緩慢或逐漸閉鎖。因此hCG注射日監(jiān)測到的卵泡總數(shù)一般低于AFC，這使hCG注射日直徑≥14 mm卵泡數(shù)占比相較于FORT比例重新分配，得出不一樣的結(jié)論。數(shù)據(jù)分析可見在hCG注射日卵泡直徑占比分組下，各組數(shù)據(jù)差距較FORT分組小，高比例組與FORT中比例組的獲卵數(shù)、臨床妊娠率及活產(chǎn)率相近。得知卵泡直徑占比這種分組方式縮小了組間差異，對臨床妊娠率和活產(chǎn)率沒有明顯影響。
除了FORT可預測妊娠結(jié)局，logistic回歸分析提示AFC與臨床妊娠密切相關(guān)。Holte等的大樣本前瞻性研究結(jié)果顯示PCOS患者助孕治療后的妊娠率及活產(chǎn)率與AFC呈線性正相關(guān)。另有研究表明，PCOS患者的獲卵數(shù)雖然在增加，但卵母細胞的質(zhì)量較差，從而導致受精率、卵裂率和種植率降低。這可能是因為卵巢內(nèi)因素［表皮生長因子（EGF）、成纖維生長因子（FGFs）、胰島素樣生長因子（IGF）家族、神經(jīng)生長因子（NGF）家族、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β家族、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）家族、細胞因子家族］和卵巢外因素（FSH缺乏、高LH、高雄激素、高胰島素）對卵母細胞的成熟和胚胎潛在發(fā)育能力產(chǎn)生負面影響。回歸分析還表明獲卵數(shù)與臨床妊娠關(guān)系不大，可能因為PCOS患者促排卵后能獲得可觀的胚胎數(shù)量，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進行移植是IVF成功的關(guān)鍵。在IVF過程中，仍要注意把握卵巢刺激的強度，不宜過多或過少，不僅要使患者一次取卵周期獲益最大化，同時要兼顧胚胎利用率、OHSS風險等方面，制定個體化的促排卵方案。
目前應(yīng)用于PCOS患者的促排卵藥物及促排卵方案較多。隨著臨床研究的深入，COH方案在長方案基礎(chǔ)上又衍生出拮抗劑方案、微刺激方案、長效長方案、超長方案等，各個方案各有其優(yōu)劣勢。本研究僅選取行卵泡期長效長方案降調(diào)節(jié)的患者進行研究，其他方案值得進一步探討。卵泡期長效長方案通過充分降調(diào)節(jié)，更理想地控制了PCOS患者異常激素水平，盡可能使多的卵泡發(fā)育成熟，同時推遲注射hCG可獲得更多的成熟卵子，發(fā)生黃素化概率低，對子宮內(nèi)膜容受性的影響小，但獲卵數(shù)的增多，亦會增加OHSS的風險［23］。PCOS是發(fā)生OHSS的高危因素之一，目前OHSS缺乏針對性強的治療方法，預防尤為重要。對PCOS患者，應(yīng)當減少Gn用量；當卵泡近成熟，血清雌激素水平過高時，可短暫停用Gn，也稱“coasting”；出現(xiàn)嚴重OHSS傾向時，可取消周期；減少hCG的扳機劑量，取卵后禁用hCG進行黃體支持等。這些方法都能一定程度降低OHSS的發(fā)生率。阿司匹林、二甲雙胍等藥物的使用也可預防OHSS的發(fā)生。另外，妊娠導致內(nèi)源性hCG大量分泌，可誘發(fā)加重OHSS的發(fā)生發(fā)展，選擇性的全部胚胎冷凍可以避免因妊娠而引起的遲發(fā)型OHSS。對于已發(fā)生OHSS的患者，應(yīng)積極對癥治療，減少嚴重并發(fā)癥的發(fā)生，以減輕患者痛苦，最終實現(xiàn)患者的生育目的。
綜上所述，在PCOS患者中，hCG注射日直徑≥14 mm卵泡數(shù)占比不影響妊娠結(jié)局，F(xiàn)ORT對于預測妊娠結(jié)局具有重要意義，中低比例FORT的患者可有較好的妊娠結(jié)局。本研究僅為回顧性研究，仍有待大樣本、多中心、前瞻性研究進一步證實。
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